ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПУТЕЙ СООБЩЕНИЯ

Кафедра: «Техносферная и экологическая безопасность»

Курсовая работа

На тему:

 Биоиндикация и биотестирование

Студента      5       курса

группы ИЗОС-815

Езопихина К.И.

_____________

 Подпись студента

Преподаватель

Тинус А.М.

Оценка ____________

Подпись преподавателя ____________

                                                                                                               Дата____________               

Санкт-Петербург

2012

СОДЕРЖАНИЕ

АННОТАЦИЯ.. 3

ВВЕДЕНИЕ.. 4

1. БИОИНДИКАЦИЯ.. 5

1.1 Общие принципы использования биоиндикаторов. 5

1.2 Особенности использования растений в качестве биоиндикаторов. 8

1.3        Особенности использования животных в качестве биоиндикаторов. 9

1.4 Особенности использования микроорганизмов в качестве биоиндикаторов. 11

1.5 Симбиологические методы в биоиндикации. 12

1.6 Области применения биоиндикаторов. 13

1.6.1 Оценка качества воздуха. 13

1.6.2 Оценка качества воды.. 14

1.6.3 Диагностика почв. 15

2. БИОТЕСТИРОВАНИЕ.. 18

2.1 Задачи и приемы биотестирования качества среды.. 18

2.2 Суть методологии биотестирования. 19

2.3 Требования к методам биотестирования. 19

2.4 Основные подходы биотестирования. 20

2.4.1 Биохимический подход. 20

2.4.2 Генетический подход. 23

2.4.3 Морфологический подход. 27

2.4.4 Физиологический подход. 29

2.4.5 Иммунологический подход. 30

2.5 Практическое применение методологии биотестирования. 32

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ... 34

 

АННОТАЦИЯ

Данная работа посвящена биоиндикации и биотестированию. А именно, рассмотрены общие принципы использования биоиндикаторов, особенности использования растений, животных, микроорганизмов в их качестве и область их  применения. Приведены суть, требования, основные подходы биеотестирования, его задачи, приемы и практическое применение. 

 

ВВЕДЕНИЕ

Контроль качества окружающей среды с использованием био­логических объектов в последние десятилетия оформился как ак­туальное научно-прикладное направление.

Биоиндикация (bioindication) — обнаружение и определение эко­логически значимых природных и антропогенных нагрузок на ос­нове реакций на них живых организмов непосредственно в среде их обитания. Биологические индикаторы обладают признаками, свойственными системе или процессу, на основании которых про­изводится качественная или количественная оценка тенденций изменений, определение или оценочная классификация состоя­ния экологических систем, процессов и явлений. В настоящее вре­мя можно считать общепринятым, что основным индикатором устойчивого развития в конечном итоге является качество среды обитания.

Биотестирование (bioassay) — процедура установления ток­сичности среды с помощью тест - объектов, сигнализирующих об опасности независимо от того, какие вещества и в каком сочета­нии вызывают изменения жизненно важных функций у тест - объек­тов. Для оценки параметров среды используются стандартизован­ные реакции живых организмов (отдельных органов, тканей, кле­ток или молекул). В организме, пребывающем контрольное время в условиях загрязнения, происходят изменения физиологических, биохимических, генетических, морфологических или иммунных систем. Объект извлекается из среды обитания, и в лабораторных условиях проводится необходимый анализ. Живой организм мо­жет тестироваться также в специальных камерах или на стендах, где создаются условия изучаемого загрязнения (что очень важно для выявления реакций организма на то или иное доминирующее загрязнение или целый комплекс известных загрязняющих веществ на данной территории обитания).

1. БИОИНДИКАЦИЯ

1.1 Общие принципы использования биоиндикаторов

Состояние биологической системы (организм, популяция, био­ценоз) в той или иной степени характеризует воздействие на нее природных или антропогенных факторов и условий среды и мо­жет применяться для их оценки.

Биоиндикаторы (от био и лат. indico — указываю, определяю) — организмы, присутствие, количество или особенности развития которых служат показателями естественных процессов, условий или антропогенных изменений среды обитания. Их индикаторная значимость определяется экологической толерантностью биоло­гической системы. В пределах зоны толерантности организм спо­собен поддерживать свой гомеостаз. Любой фактор, если он выхо­дит за пределы «зоны комфорта» для данного организма, являет­ся стрессовым. В этом случае организм реагирует ответной реакци­ей различной интенсивности и длительности, проявление кото­рой зависит от вида и является показателем его индикаторной ценности. Именно ответную реакцию определяют методы биоин­дикации. Биологическая система реагирует на воздействие среды в целом, а не только на отдельные факторы, причем амплитуда колебаний физиологической толерантности модифицируется внут­ренним состоянием системы — условиями питания, возрастом, генетически контролируемой устойчивостью.

Многолетний опыт ученых разных стран по контролю состоя­ния окружающей среды показал преимущества, которыми обла­дают живые индикаторы:

·        в условиях хронических антропогенных нагрузок могут реаги­ровать даже на относительно слабые воздействия вследствие ку­мулятивного эффекта; реакции проявляются при накоплении не­которых критических значений суммарных дозовых нагрузок;

·        суммируют влияние всех без исключения биологически важ­ных воздействий и отражают состояние окружающей среды в це­лом, включая ее загрязнение и другие антропогенные изменения;

·        исключают необходимость регистрации химических и фи­зических параметров, характеризующих состояние окружающей среды;

·        фиксируют скорость происходящих изменений;

·        вскрывают тенденции развития природной среды;

·        указывают пути и места скоплений в экологических системах различного рода загрязнений и ядов, возможные пути их попада­ния в пищу человека;

·        позволяют судить о степени вредности любых синтезируемых человеком веществ для живой природы и для него самого, при­чем дают возможность контролировать их действие.

Выделяют две формы отклика живых организмов, используе­мых в целях биоиндикации, — специфическую и неспецифическую. В первом случае происходящие изменения связаны с действием одного какого-либо фактора. При неспецифической биоиндика­ции различные антропогенные факторы вызывают одинаковые ре­акции.

В зависимости от типа ответной реакции биоиндикаторы под­разделяют на чувствительные и кумулятивные. Чувствительные биоиндикаторы реагируют на стресс значительным отклонением от жизненных норм, а кумулятивные накапливают антропогенное воздействие, значительно превышающее нормальный уровень в природе, без видимых изменений.

В качестве биоиндикаторов могут быть использованы предста­вители всех «царств» живой природы. Для биоиндикации не при­годны организмы, поврежденные болезнями, вредителями и па­разитами. Идеальный биологический индикатор должен удовлет­ворять ряду требований:

·        быть типичным для данных условий;

·        иметь высокую численность в исследуемом экотопе;

·        обитать в данном месте в течение ряда лет, что дает возмож­ность проследить динамику загрязнения;

·        находиться в условиях, удобных для отбора проб;

·        давать возможность проводить прямые анализы без предвари­тельного концентрирования проб;

·        характеризоваться положительной корреляцией между кон­центрацией загрязняющих веществ в организме-индикаторе и объекте исследования;

·        использоваться в естественных условиях его существования;

·        иметь короткий период онтогенеза, чтобы была возможность отслеживания влияния фактора на последующие поколения.

Ответная реакция биоиндикатора на определенное физическое или химическое воздействие должна быть четко выражена, т.е. специфична, легко регистрироваться визуально или с помощью приборов.

При выборе индикатора необходимо принимать во внимание соображения экономии и учитывать характер использования тех или иных организмов. Например, широко распространенные на исследуемой территории, и не занесенные в «Красную книгу».

На уровне популяции биоиндикация проводится в том случае, если процесс распространения негативных изменений охватывает такое количество особей, при котором заметно сокращается чис­ленность популяции, изменяется ее половозрастная структура, сокращается продолжительность жизни, происходит сдвиг фено­логических фаз и др.

Экосистемный подход к оценке среды дает возможность ран­ней диагностики ее изменений. Сигналом тревоги служит разбалансировка продукционно - деструкционных процессов. Диагно­стическими признаками таких сдвигов являются, например, на­копление органического вещества, заиление, зарастание водоемов, усиленное развитие микроорганизмов.

В качестве объектов для биоиндикации применяются разнообраз­ные организмы — бактерии, водоросли, высшие растения, беспоз­воночные животные, млекопитающие. Для гарантированного выяв­ления присутствия в природных средах токсического агента неизве­стного химического состава, как правило, используется набор объек­тов, представляющих различные группы сообщества. С введением каждого дополнительного объекта эффективность схемы испытаний повышается, однако нет смысла бесконечно расширять ассортимент обязательных объектов для использования в такой оценке.

Для биоиндикации необходимо выбирать наиболее чувствитель­ные сообщества, характеризующиеся максимальными скоростью отклика и выраженностью параметров. Например, в водных эко­системах наиболее чувствительными являются планктонные со­общества, которые быстро реагируют на изменение среды благо­даря короткому жизненному циклу и высокой скорости воспро­изводства. Бентосные сообщества, где организмы имеют доста­точно длинный жизненный цикл, более консервативны: перестрой­ки происходят в них при длительном хроническом загрязнении, приводящем к необратимости процессов.

К методам биоиндикации, которые можно применять при ис­следовании экосистемы, относится выявление в изучаемой зоне редких и исчезающих видов. Список таких организмов, по сути, является набором индикаторных видов, наиболее чувствительных к антропогенному воздействию.

1.2 Особенности использования растений в качестве биоиндикаторов

С помощью растений можно проводить биоиндикацию всех природных сред. Индикаторные растения используются при оцен­ке механического и кислотного состава почв, их плодородия, ув­лажнения и засоления, степени минерализации грунтовых вод и степени загрязнения атмосферного воздуха газообразными соединениями, а также при выявлении трофических свойств водоемов и степени их загрязнения поллютантами. Например, на содержа­ние в почве свинца указывают виды овсяницы (Festuca ovina и др.), полевицы (Agrostis tenuis и др.); цинка — виды фиалки (Viola tricolor и др.), ярутки (Tlaspi alpestre и др.); меди и кобальта — смолевки (Silene vulgaris и др.), многие злаки и мхи.

Чувствительные фитоиндикаторы указывают на присутствие загрязняющего вещества в воздухе или почве ранними морфоло­гическими реакциями — изменением окраски листьев (появление хлорозов; желтая, бурая или бронзовая окраска), различной фор­мы некрозами, преждевременным увяданием и опаданием листвы. У многолетних растений загрязняющие вещества вызывают изме­нение размеров, формы, количества органов, направления роста побегов или изменение плодовитости. Подобные реакции обычно неспецифичны.

Некоторые естественные факторы могут вызывать симптомы, сходные с антропогенными нарушениями. Так, например, хлороз листьев может быть вызван недостатком железа в почве или ран­ним заморозком. Поэтому при определении морфологических из­менений у растений необходимо учитывать возможность действия других повреждающих факторов.

Индикаторы другого типа представляют собой растения-акку­муляторы. Они накапливают в своих тканях загрязняющее веще­ство или вредные продукты метаболизма, образуемые под дей­ствием загрязняющих веществ, без видимых изменений. При пре­вышении порога токсичности ядовитого вещества для данного вида проявляются различные ответные реакции, выражающиеся в из­менении скорости роста и длительности фенологических фаз, биометрических показателей и, в конечном счете, снижении про­дуктивности.

Получить точные количественные данные о динамике и вели­чине стрессовых воздействий на основе морфологических измене­ний невозможно, но можно довольно точно определить величину потерь продукции и, имея график зависимости «доза — эффект», рассчитать величину стрессового воздействия.

Б. В. Виноградов классифицировал индикаторные признаки ра­стений как флористические, физиологические, морфологические и фитоценотические. Флористическими признаками являются раз­личия состава растительности изучаемых участков, сформировав­шиеся вследствие определенных экологических условий. Индика­торное значение имеет как присутствие, так и отсутствие вида. К физиологическим признакам относятся особенности обмена ве­ществ растений, к анатомо-морфологическим признакам — осо­бенности внутреннего и внешнего строения, различного рода ано­малии развития и новообразования, к фитоценотическим при­знакам — особенности структуры растительного покрова: обилием рассеянность видов растений, ярусность, мозаичность, степень сомкнутости.

Очень часто в целях биоиндикации используются различные аномалии роста и развития растения — отклонения от общих за­кономерностей. Ученые систематизировали их в три основные груп­пы, связанные: (1) с торможением или стимулированием нор­мального роста (карликовость и гигантизм); (2) с деформациями стеблей, листьев, корней, плодов, цветков и соцветий; (3) с воз­никновением новообразований (к этой группе аномалий роста относятся также опухоли).

Гигантизм и карликовость многие исследователи считают урод­ствами. Например, избыток в почве меди вдвое уменьшает разме­ры калифорнийского мака, а избыток свинца приводит к карли­ковости смолевки.

В целях биоиндикации представляют интерес следующие де­формации "растений:

·        фасциация — лентовидное уплощение и сращение стеблей, корней и цветоносов;

·        махровость цветков, в которых тычинки превращаются в ле­пестки;

·        пролификация — прорастание цветков и соцветий;

·        асцидия — воронковидные, чашевидные и трубчатые листья у растений с пластинчатыми листьями;

·        редукция — обратное развитие органов растений, вырождение;

·        нитевидность — нитчатая форма листовой пластинки;

·        филлодий тычинок — превращение их в плоское листовидное образование.

Биомониторинг может осуществляться путем наблюдений за отдельными растениями-индикаторами, популяцией определен­ного вида и состоянием фитоценоза в целом. На уровне вида обычно производят специфическую индикацию какого-то одного загряз­нителя, а на уровне популяции или фитоценоза — общего состо­яния природной среды.

1.3   Особенности использования животных в качестве биоиндикаторов

Позвоночные животные также служат хорошими индикатора­ми состояния среды благодаря следующим особенностям:

·        являясь консументами, они находятся на разных трофических уровнях экосистем и аккумулируют через пищевые цепи загряз­няющие вещества;

·        обладают активным обменом веществ, что способствует быст­рому проявлению воздействия негативных факторов среды на орга­низм

·        имеют хорошо дифференцированные ткани и органы, кото­рые обладают разной способностью к накоплению токсических веществ и неоднозначностью физиологического отклика, что по­зволяет исследователю иметь широкий набор тестов на уровне тканей, органов и функций;

·        сложные приспособления животных к условиям среды и чет­кие поведенческие реакции наиболее чувствительны к антропо­генным изменениям, что дает возможность непосредственно на­блюдать и анализировать быстрые отклики на оказываемое воз­действие;

·        животных с коротким циклом развития и многочисленным потомством можно использовать для проведения ряда длительных наблюдений и прослеживать воздействие фактора на последующие поколения; для долгоживущих животных можно выбрать особо чувствительные тесты в соответствии с особо уязвимыми этапами онтогенеза.

Основное преимущество использования позвоночных живот­ных в качестве биоиндикаторов заключается в их физиологиче­ской близости к человеку. Основные недостатки связаны со слож­ностью их обнаружения в природе, поимки, определения вида, а также с длительностью морфо - анатомических наблюдений. Кроме того, эксперименты с животными зачастую дороги, требуют мно­гократной повторяемости для получения статистически достовер­ных выводов.

Оценка и прогнозирование состояния природной среды с при­влечением позвоночных животных проводятся на всех уровнях их организации. На организменном уровне с помощью сравнитель­ного анализа оцениваются морфо - анатомические, поведенческие и физиолого-биохимические показатели.

Морфо - анатомические показатели описывают особенности внешнего и внутреннего строений животных и их изменение под воздействием определенных факторов (депигментация, измене­ние покровов, структуры тканей и расположения органов, воз­никновение уродств, опухолей и других патологических проявле­ний).

Поведенческие и физиолого - биохимические параметры особен­но чувствительны к изменению внешней среды. Токсиканты, про­никая в кости или кровь позвоночных животных, сразу же воз­действуют на функции, обеспечивающие жизнедеятельность. Даже при узкоспецифичном влиянии токсиканта на определенную фун­кцию ее сдвиги отражаются на состоянии всего организма вслед­ствие взаимосвязанности процессов жизнедеятельности. Доста­точно отчетливо присутствие токсикантов проявляется в нару­шении ритма дыхания, сердечных сокращений, скорости пище­варения, ритмике выделений, продолжительности циклов раз­множения.

Для того чтобы иметь возможность сравнивать материал, со­бранный разными исследователями в различных районах, набор видов-индикаторов должен быть един и невелик. Вот некоторые критерии пригодности различных видов млекопитающих для био­индикационных исследований:

·        принадлежность к разным звеньям трофической цепи — рас­тительноядным, насекомоядным, хищным млекопитающим;

·        оседлость или отсутствие больших миграций;

·        широкий ареал распространения (сравнительно высокая эв-ритопность), т.е. этот критерий исключает использование в каче­стве тест-индикаторов эндемиков;

·        принадлежность к естественным сообществам: критерий ис­ключает синантропные виды, питающиеся вблизи жилища чело­века и неадекватно характеризующие микроэлементный состав загрязнения данного региона;

·        численность вида должна обеспечивать достаточный матери­ал для анализа;

·        простота и доступность методов добывания видов.

Анализируя по данным критериям представителей всех отря­дов млекопитающих, встречающихся на территории стран СНГ, можно остановиться на семи видах: обыкновенная бурозубка (Sores areneus), европейский крот (Talpa europaea), алтайский крот (Talpa altaica), бурый медведь (Ursus arctos), лось (Alces alces), рыжая по­левка (Clethrionomysglareolus), красная полевка (Clethrionomys rubilus).

1.4 Особенности использования микроорганизмов в качестве биоиндикаторов

Микроорганизмы — наиболее быстро реагирующие на измене­ние окружающей среды биоиндикаторы. Их развитие и активность находятся в прямой связи с составом органических и неоргани­ческих веществ в среде, так как микроорганизмы способны раз­рушать соединения естественного и антропогенного происхожде­ний. На этом основаны принципы биоиндикации с использованием микроорганизмов. Необходимо иметь сведения о составе, количестве и функциональной активности последних.

При прямом микроскопировании, например воды, количество обнаруживаемых микроорганизмов оказывается небольшим, по­этому для изучения морфологического разнообразия и оценок их общего числа в единице объема проводят концентрирование про­бы. Для фильтрации воды используют фильтры Зейтца или иной конструкции с размером пор 0,35; 0,5; 0,23; 0,3; 0,4 мкм. Объем фильтруемой воды может быть от 10 до 20 мл в зависимости от типа водоема. Для подсчета численности микроорганизмов фильтр прокрашивают, переносят на предметное стекло в каплю иммер сионного масла и микроскопируют с перемещением сетчатого микрометра.

Выявление микроорганизмов и их учет можно произвести пу­тем высева проб в жидкие и агаризованные питательные среды. Для учета сапрофитов используют мясопептонный агар, олиго-трофных бактерий выращивают на агаризованной воде из иссле­дуемого водоема.

Чаще всего для оценки качества вод используют показатель микробного числа — это число клеток аэробных сапрофитных орга­низмов в I мл воды. В чистых водоемах число сапрофитов может исчисляться десятками и сотнями, а в загряз­ненных и грязных водоемах этот показатель достигает сотен тысяч и миллионов.

Помимо микробного числа используются данные по видовому составу микроорганизмов. В полисапробной зоне наблюдается мас­совое развитие нитчатых бактерий. В загрязненной фекалиями воде высок коли-индекс, характеризующий наличие в среде энтеро-бактерий Escherichia coli — условных патогенов и постоянных оби­тателей кишечника человека и животного.

1.5 Симбиологические методы в биоиндикации

Симбиоз широко распространен в природе, а симбиотические ассоциации часто играют ключевую роль в поддержании нормаль­ного функционирования наземных, пресноводных и морских эко­систем. Симбиоз грибов и азотфиксирующих бактерий с высшими растениями и водорослей с грибами обеспечил процветание этих ассоциаций в наземной среде. Лишайники, симбиотическая ассо­циация водорослей и грибов, очень чувствительны к качеству среды и уже давно используются как традиционные биомаркеры состо­яния атмосферного воздуха (см. гл. 4). Мадрепоровые кораллы (скле-рактинии) — симбиоз одноклеточных водорослей зооксантелл с кишечнополостными животными, определяющий важную ландшафтообразующую роль этой ассоциации в тропических морях. Все более значительной признается роль симбиотических микро­организмов в трофике практически всех видов организмов. Прямо или косвенно регулируя численность своих хозяев, симбионты ока­зывают существенное влияние на их динамику численности и структуру популяции. Биоразнообразие симбионтов (паразитов, комменсалов, мутуалистов), как правило, значительно превыша­ет разнообразие их хозяев. Так, на Большом Барьерном рифе (ко­ралловая постройка) водится около 2 000 видов рыб, а их парази-тофауна представлена более чем 20000 видов; три вида австра­лийских промысловых креветок в качестве симбионтов имеют 38 видов организмов из разных систематических групп.

Помимо уточнения оценки биоразнообразия по числу видов учет симбионтов позволяет получать достоверную информацию о качестве среды, так как степень интенсивности инвазии (относи­тельное количество хозяев, имеющих симбионтов) и экстенсив­ность инвазии (среднее количество симбионтов на хозяине) на­прямую зависят от условий, в которых находится популяция хо­зяев. Многие симбионты чувствительны к изменениям внешней среды, в частности симбионты водных организмов — к загрязне­нию и опреснению, а симбионты наземных организмов — к ра­дионуклидам. При оценке разнообразия фауны симбионтов ши­роко используют статистические методы. Учет симбиотических, в том числе и паразитических, организмов, а также исследование состояния симбиотических ассоциаций позволяют более точно оценить биоразнообразие и характер динамических процессов в экосистемах и могут быть рекомендованы в качестве важных эле­ментов экодиагностических исследований.

1.6 Области применения биоиндикаторов

1.6.1 Оценка качества воздуха

Как известно, воздух представляет собой смесь определенных газов, повсюду на Земле представленных приблизительно в рав­ных объемных долях. Загрязнение воздуха имеет место в том слу­чае, если в смеси имеются вещества в таких количествах и так долго, что создают опасность для человека, животных, растений или имущества. От загрязнения воздуха страдают все живые орга­низмы, но особенно растения. По этой причине растения, в том числе низшие, наиболее пригодны для обнаружения начального изменения состава воздуха. Соответствующие индексы дают коли­чественное представление о токсичном эффекте загрязняющих воздух веществ.

Лишайники являются симбиотическими организмами. Многи­ми исследователями показана их пригодность для целей биоинди­кации. Они обладают весьма специфическими свойствами, так как реагируют на изменение состава атмосферы, обладают отличной от других организмов биохимией, широко распространены по раз­ным типам субстратов, начиная со скал и кончая корой и листь­ями деревьев, удобны для экспозиции в загрязненных районах.

Выделяют четыре основные экологические группы лишайни­ков: эпифитные — растущие на коре деревьев и кустарников; эпи-ксилъные — растущие на обнаженной древесине; эпигейные — на почве; эпилитные — на камнях. Из них наиболее чувствительны к загрязнению воздуха эпифитные виды. С помощью лишайников можно получать вполне достоверные данные об уровне загрязне­ния воздуха. При этом можно выделить группу химических соеди­нений и элементов, к действию которых лишайники обладают сверхповышенной чувствительностью: оксиды серы и азота, фторо- и хлороводород, а также тяжелые металлы. Многие лишайни­ки погибают при невысоких уровнях загрязнения атмосферы эти­ми веществами. Процедура определения качества воздуха с помо­щью лишайников носит название лихеноиндикации.

Оценку чистоты воздуха можно проводить с помощью высших растений. Например, голосеменные — отличные индикаторы чи­стоты атмосферы. Возможно также изучение мутаций в волосках тычиночных нитей традесканции. Французские ученые подмети­ли, что при увеличении в воздухе окиси углерода и окислов азо­та, выбрасываемых двигателями внутреннего сгорания, окраска ее тычиночных нитей меняется от синей к розовой. По­следствия нарушений в индивидуальном развитии растений могут быть выявлены также по частоте встречаемости морфологических отклонений (фенодевиантов), величине показателей флуктуиру­ющей асимметрии (отклонение от совершенной билатеральной и радиальной симметрии), методом анализа сложноорганизованных комплексных структур (фрактал-анализ). Уровни любых от­клонений от нормы оказываются минимальными лишь при оп­тимальных условиях и возрастают при любых стрессирующих воз­действиях.

1.6.2 Оценка качества воды

Прежде всего надо помнить, что биологическое исследование изучает не воду, а водоем в целом как единую экосистему. Н. С. Строганов определил водную токсикологию как науку о ток­сичности среды обитания гидробионтов на всех уровнях органи­зации живого, которая изучает все реакции гидробионтов на за­грязнение любого происхождения.

Для того чтобы оценить уровень токсического загрязнения вод­ного объекта промышленными или иными стоками, нужно отве­тить на вопросы: токсична ли исходная вода, поступающая в во­доем со сточными водами; какова степень ее токсичности; на ка­ком расстоянии от источника загрязнения токсичность снижается до минимального значения. В качестве эквивалента было исполь­зовано разведение сточной жидкости, при котором еще наблюда­ется повреждающий эффект по примененному биотесту. Ориен­тируясь как на основной показатель токсичности химических ве­ществ для гидробионтов на величину медиальной летальной кон­центрации , принятую в общей (медицинской) токсиколо­гии для теплокровных животных, Н.С.Строганов предложил ко­личественное определение токсичности как величины, обратной медиальной летальной концентрации, устанавливаемой в 48-часовом опыте.

Для биологической индикации качества вод могут быть исполь­зованы практически все группы организмов, населяющие водо­емы: планктонные и бентосные беспозвоночные, простейшие, водоросли, макрофиты, бактерии и рыбы. Каждая из них, высту­пая в роли биологического индикатора, имеет свои преимуще­ства и недостатки, которые определяют границы ее использова­ния при решении задач биоиндикации, так как все эти группы играют ведущую роль в общем круговороте веществ в водоеме. Орга­низмы, которые обычно используют в качестве биоиндикаторов, ответственны за самоочищение водоема, участвуют в создании первичной продукции, осуществляют трансформацию веществ и энергии в водных экосистемах. Всякое заключение по результатам биологического исследования строится на основании совокупно­сти всех полученных данных, а не на основании единичных нахо­док индикаторных организмов. Как при выполнении исследова ния, так и при оценке полученных результатов необходимо иметь в виду возможность случайных, местных загрязнений в точке на­блюдения. Например, разлагающиеся растительные остатки, труп лягушки или рыбы могут_вызывать местные изменения в характе­ре населения водоема.      

1.6.3 Диагностика почв

В основе принципа биологической диагностики почв лежит представление о том, что почва как среда обитания составляет единую систему с населяющими ее популяциями разных организ­мов.

Лучше других разработаны ботанические методы фитоиндикации и диагностики почв. Например, путем анализа состава и струк­туры растительных сообществ, распространения растений-инди­каторов или определенных индикационных признаков у отдель­ных видов растений можно установить тип почвы, степень ее гидроморфизма, развитие процессов заболачивания, соленакопления и т.д. Среди растений обнаружены индикаторы на тот или иной механический и химический состав почв, степень обогащения питательными элементами, на кислотность или щелочность, глу­бину протаивания мерзлотных почв или уровень грунтовых вод.

Теоретической предпосылкой применения почвенно-зоологического метода для целей диагностики почв является сформули­рованное М.С.Гиляровым в 1949 г. представление об «экологи­ческом стандарте» вида — потребности вида в определенном ком­плексе условий среды. Каждый вид в пределах своего ареала встре­чается только в тех местообитаниях, которые обеспечивают пол­ный комплекс необходимых для проявления жизнедеятельности условий. Амплитуда варьирования отдельных факторов среды ха­рактеризует экологическую пластичность вида. Эврибионты мало пригодны для индикационных целей, тогда как стенобионты слу­жат хорошими индикаторами определенных условий среды и свойств субстрата. Это положение представляет собой общий тео­ретический принцип в биологической диагностике. Однако ис­пользование для индикации одного вида не дает полной уверен­ности в правильности выводов (здесь имеет место «правило сме­ны местообитаний» и как следствие смена экологических харак­теристик вида). Лучше исследовать весь комплекс организмов, из которых одни могут быть индикаторами на влажность, другие — на температуру, третьи — на химический или механический со­став. Чем больше общих видов почвенных животных встречается на сравниваемых участках, тем с большей долей вероятности можно судить о сходстве их режимов, а следовательно, о единстве почво­образовательного процесса. Менее других полезны микроскопи­ческие формы — простейшие и микроартроподы (клещи, ного-хвостки). Их представители отличаются космополитизмом в силу того, что почва для них не выступает как единая среда обитания: они живут в системе пор, капилляров, полостей, которые можно найти в любой почве. Из микроартропод наиболее хорошо изуче­ны индикаторные свойства панцирных клещей. Состав их комп­лексов сообществ зависит не только от почвенных условий, но и от характера и флористического состава растительности, поэтому данный объект перспективно использовать для индикации повреж­дающих воздействий на почву.

Особенно ценны и удобны для индикационных работ сооб­щества крупных беспозвоночных (дождевые черви, многонож­ки, личинки насекомых). Так, стафилиниды рода Bledius и чер­нотелки рода Belopus показательны для солончаково-солонцовых почв, многоножки-кивсяки, некоторые мокрецы и легочные моллюски служат индикаторами содержания в почве извести. Дождевые черви Octolasium lacteum и некоторые виды проволоч­ников являются показателями высокого содержания кальция в грунтовых водах.

Интерес представляет почвенно-альгологическая диагностика, в основе которой лежит положение о том, что зональности почв и растительности соответствует зональность водорослевых группи­ровок. Она проявляется в общем видовом составе и комплексе доминантных видов водорослей, наличии специфических видов, характере распространения по почвенному профилю, преоблада­нии определенных жизненных форм.

Микробиологическая и биохимическая характеристика почв — наиболее сложные разделы почвенной биодиагностики. Микроор­ганизмы — очень чуткие индикаторы, резко реагирующие на раз­личные изменения в среде. Отсюда необычайная динамичность микробиологических показателей. Почва характеризуется не толь­ко составом и численностью разных групп биоты, но и их сум­марной активностью, а также активностью биохимических про­цессов, обусловленных наличием определенного пула ферментов, выделенных в результате жизнедеятельности растений, животных и микроорганизмов, а также аккумулированных почвой после раз­рушения клеток. Показателями биологической активности почв, применяемых в биоиндикации, могут служить количественные ха­рактеристики численности и биомассы разных групп почвенной биоты, их общая продуктивность, некоторые энергетические дан­ные, активность основных процессов, связанных с круговоротом элементов, ферментативная активность почв, а также количество и скорость накопления некоторых продуктов жизнедеятельности почвообитающих организмов.

Наиболее общими являются методы, позволяющие оценить суммарные биологические процессы по исходным или конечным продуктам: методы определения дыхания почвы по поглощению 0₂ или выделению С0₂; учет активности азотфиксации по восста­новлению ацетилена; микрокалориметрические измерения для установления уровня термостойкости; аппликационные методы с применением специальных материалов (целлюлозы, хроматогра-фической бумаги, целлофана) для оценки скорости и степени их разложения и накопления продуктов метаболизма, например ами­нокислот.

2. БИОТЕСТИРОВАНИЕ

Биотестирование (bioassay) — процедура установления ток­сичности среды с помощью тест - объектов, сигнализирующих об опасности независимо от того, какие вещества и в каком сочета­нии вызывают изменения жизненно важных функций у тест - объек­тов. Для оценки параметров среды используются стандартизован­ные реакции живых организмов (отдельных органов, тканей, кле­ток или молекул). В организме, пребывающем контрольное время в условиях загрязнения, происходят изменения физиологических, биохимических, генетических, морфологических или иммунных систем. Объект извлекается из среды обитания, и в лабораторных условиях проводится необходимый анализ. Живой организм мо­жет тестироваться также в специальных камерах или на стендах, где создаются условия изучаемого загрязнения (что очень важно для выявления реакций организма на то или иное доминирующее загрязнение или целый комплекс известных загрязняющих веществ на данной территории обитания).

2.1 Задачи и приемы биотестирования качества среды

В выявлении антропогенного загрязнения среды наряду с хи­мико-аналитическими методами находят применение приемы, основанные на оценке состояния отдельных особей, подвергаю­щихся воздействию загрязненной среды, а также их органов, тка­ней и клеток. Их применение вызвано технической усложненно­стью и ограниченностью информации, которую могут предоста­вить химические методы. Кроме того, гидрохимические и хими­ко-аналитические методы могут оказаться неэффективными из-за недостаточно высокой их чувствительности. Живые организмы способны воспринимать более низкие концентрации веществ, чем любой аналитический датчик, в связи с чем биота может быть подвержена токсическим воздействиям, не регистрируемым тех­ническими средствами.

Как было показано, биоиндикация предусматривает вы­явление уже состоявшегося или накапливающегося загрязнения по индикаторным видам живых организмов и экологическим ха­рактеристикам сообществ организмов. Пристальное внимание в настоящее время уделяется приемам биотестирования, т.е. исполь­зования в контролируемых условиях биологических объектов в качестве средства выявления суммарной токсичности среды. Био­тестирование представляет собой методический прием, основан­ный на оценке действия фактора среды, в том числе и токсиче­ского, на организм, его отдельную функцию или систему органов и тканей.

Кроме выбора биотеста существенную роль играет выбор тест реакции — того параметра организма, который измеряется при тестировании.

Наиболее информативны интегральные параметры, характе­ризующие общее состояние живой системы соответствующего уровня. Для отдельных организмов к интегральным параметрам обычно относят характеристики выживаемости, роста, плодови­тости, тогда как физиологические, биохимические, гистологи­ческие и прочие параметры относят к частным. Для популяций интегральными параметрами являются численность и биомасса, а для экосистем — характеристики видового состава, активнос­ти продукции и деструкции органического вещества.

С увеличением интегральности тест - реакции повышается «эко­логический реализм» теста, но обычно снижаются его оператив­ность и чувствительность. Функциональные параметры оказыва­ются более лабильными, чем структурные, а параметры клеточ­ного и молекулярного уровней проигрывают в отношении эколо­гической информативности, но выигрывают в отношении чув­ствительности, оперативности и воспроизводимости.

2.2 Суть методологии биотестирования

Предлагаемая система биомониторинга представляет собой ком­плекс различных подходов для оценки состояния разных организ­мов, находящихся под воздействием комплекса как естественных, так и антропогенных факторов. Фундаментальным показателем их состояния является эффективность физиологических процессов, обеспечивающих нормальное развитие организма. В оптимальных условиях организм реагирует на воздействие среды посредством сложной физиологической системы буферных гомеостатических механизмов. Эти механизмы поддерживают оптимальное протека­ние процессов развития. Под воздействием неблагоприятных усло­вий механизмы поддержания гомеостаза могут быть нарушены, что приводит к состоянию стресса. Такие нарушения могут происхо­дить до появления изменений обычно используемых параметров жизнеспособности. Таким образом, методология биотестирования, основанная на исследовании эффективности гомеостатических ме­ханизмов, позволяет уловить присутствие стрессирующего воздей­ствия раньше, чем многие обычно используемые методы.

2.3 Требования к методам биотестирования

Для того чтобы быть пригодными для решения комплекса со­временных задач, методы биотестирования, используемые для оценки среды, должны соответствовать следующим требованиям: быть применимыми для оценки любых экологических изменений среды обитания живых организмов; характеризовать наиболее об­щие и важные параметры жизнедеятельности биоты; быть доста­точно чувствительными для выявления даже начальных обрати­мых экологических изменений; быть адекватными для любого вида живых существ и любого типа воздействия; быть удобными не только для лабораторного моделирования, но также и для иссле­дований в природе; быть достаточно простыми и не слишком до­рогостоящими для широкого использования.

Одним из наиболее важных требований при оценке состояния среды является чувствительность применяемых методов. Потреб­ность в таких методах особенно возрастает в настоящее время, когда в силу повышенного внимания к проблемам охраны приро­ды и в связи с развитием природоохранных мероприятий стано­вится необходимым оценивать не только и не столько существен­ные, как правило, уже необратимые изменения в среде, но пер­воначальные незначительные отклонения, когда еще возможно вернуть систему в прежнее нормальное состояние.

Другое важное требование — универсальность как в отноше­нии физического, химического или биологического оцениваемо­го воздействия, так и типа экосистем и вида живых существ, по отношению к которым такая оценка проводится. Причем, это не­обходимо как в отношении отдельных агентов, так и кумулятив­ного воздействия любого их сочетания (включая весь комплекс как антропогенных, так и естественных факторов).

Система должна быть относительно простой и доступной, при­годной для широкого использования. В настоящее время существует ряд современных молекулярно-биологических тестов качества сре­ды, но в силу высокой технологической сложности и стоимости их применение оказывается ограниченным. При этом возникает вопрос: нужно ли прибегать к таким сложным методам при реше­нии общей задачи мониторинга состояния среды и нельзя ли по­лучить сходную информацию более доступным способом.

2.4 Основные подходы биотестирования

2.4.1 Биохимический подход

Стрессовое воздействие среды можно оценивать по эффектив­ности биохимических реакций, уровню ферментативной актив­ности и накоплению определенных продуктов обмена. Изменения содержания в организме определенных биохимических соедине­ний (например, терпеноидов), показателей базовых биохимиче­ских процессов (например, концентрации хлорофилла у фотосин-тезирующих растений) и структуры ДНК в результате биохими­ческих реакций (например, при оксидантном стрессе) могут обес­печить необходимую информацию о реакции организма в ответ на стрессовое воздействие.

Измерение адаптационного стресса. Каждый физиологический процесс требует определенных затрат энергии, поэтому любое изменение физиологического состояния немедленно сказывается на энергетическом обмене. Биоэнергетические показатели живых систем позволяют выявлять последствия стрессового воздействия среды до наступления необратимых изменений в организме.

Количество энергии, необходимое организму в единицу вре­мени для обеспечения всех физиологических процессов, характе­ризует интенсивность энергетического обмена. На реализацию одного и того же физиологического процесса в неблагоприятных условиях организму требуется больше энергии, чем в оптималь­ных, из-за необходимости компенсации неблагоприятных воздей­ствий среды.

В процессе жизнедеятельности всех аэробных организмов в ходе нормальных реакций кислородного метаболизма образуются сво­бодные радикалы (CP) супероксид и другие формы активного кислорода. В норме уровень CP регулируется системой антиоксидантной защиты клетки, так как эти радикалы и продукты их пре­вращения представляют серьезную угрозу: подавляют активность ферментов, разрушают нуклеиновые кислоты, вызывают дегра­дацию биополимеров, изменяют проницаемость мембран. Высо­кий уровень образования супероксидных радикалов токсичен и может вызвать гибель организма. Уровень их образования, слегка превышающий базовый, может стимулировать рост клеток и иг­рает важную роль в процессе канцерогенеза. Одним из универ­сальных механизмов стресса является развитие окислительных СР-реакций. Под действием окислительного стресса может происхо­дить повреждение ДНК. Один из механизмов такого повреждения включает прямое окисление нуклеиновых кислот, другой — пере­варивание ДНК. Образование супероксидных радикалов увеличи­вается при разных видах облучений, изменении парциального дав­ления кислорода под влиянием ксенобиотиков и при других воз­действиях.

Метаболические свободные радикалы — это обширная группа высокоактивных интермедиатов, играющих важную роль в окис­лительно-восстановительных биохимических реакциях. В клетках животных общепризнано участие CP-реакций при действии окис­лительных ферментов в системах цитохромов и других темопротеидов, НАД, фловопротеидов, убихинона, осуществляемых с по­мощью коферментов-переносчиков электронов. Свободнорадикальные состояния возникают также в процессах аутоокисления био­логически важных соединений, в особенности липидов. В послед­нем случае чаще всего имеет место образование липидных гидро­перекисей, распад которых также приводит к образованию актив­ных радикалов. Особенно подвержены такому аутоокислению не­насыщенные жирные кислоты — компоненты липидов биологических мембран. Появление CP-состояний в липидах клеточной мембраны приводит к модификации ее физико-химического со­стояния и активности мембранно-связанных ферментов. При по­вреждающих воздействиях на клетки процессы перекисного окис­ления липидов развиваются тем более активно, чем выше степень повреждения клетки. При этом перекисные радикалы могут взаи­модействовать с молекулами белков или нуклеиновых кислот, свя­занными с мембраной, изменяя биологические свойства этих мо­лекул и клетки в целом.

Стрессовая реакция биотестов может быть измерена по изме­нению в них уровня свободных радикалов по сравнению с конт­ролем. Известно, что быстрые изменения интенсивности СР-ре-акций в живых объектах типичны для начальных стадий разных патологических состояний, в том числе для первичных процессов лучевого поражения. В значительной мере это зависит от развития перекисного окисления липидов мембран и определяет неспеци­фический окислительный стресс клетки. При этом нарушается го-меостатическое равновесие, клетки выходят в неустойчивое со­стояние, повышается их реактивность.

Исследование ферментативной активности почвенного микроце­ноза. Различные виды антропогенного воздействия на почву мо­гут изменять условия существования почвенных микроорганиз­мов, нарушать нормальное протекание в почвах процессов мик­робной трансформации и, следовательно, отражаются на процес­сах трансформации веществ в биосфере. Почвенные микроорга­низмы участвуют в циклах жизненно-важных элементов, таких как N, Р, S, Fe, Мп и др. Им принадлежит уникальная роль в очистке биосферы от загрязнений, так как именно микроорганизмы обла­дают высокой способностью к адаптации и могут быстро транс­формировать загрязняющие вещества, как естественные для био­сферы, так и чужеродные.

Изучение сукцессии и особенностей функционирования мик­робных комплексов в техногенных экосистемах представляет боль­шой научный и практический интерес. Такие экосистемы могут служить моделью для исследования скорости и направления мик­робиологических и биохимических процессов.

Методы энзимологии широко применяются при решении эко­логических задач. Они позволяют оценить биохимическую актив­ность почвенного микроценоза. Ферменты, выделяемые микроор­ганизмами в результате их жизнедеятельности, способны иммо­билизоваться и накапливаться в почве в активном состоянии и в соответствующих условиях проявлять специфические биокатали­тические функции.

К настоящему времени разработаны методы определения ак­тивности большого количества ферментов, участвующих в разно­образных почвенных биохимических процессах.

По типу катализируемых реакций все известные ферменты раз­делены на шесть классов: оксидоредуктазы, катализирующие окис­лительно-восстановительные реакции; гидролазы, катализирующие реакции гидролитического расщепления внутримолекулярных свя­зей в различных соединениях; трансферазы, катализирующие ре­акции межмолекулярного или внутримолекулярного переноса хи­мической группы и остатков с одновременным переносом энер­гии, заключенной в химических связях; лигазы (синтетазы), ката­лизирующие реакции соединения двух молекул, сопряженные с расщеплением пирофосфатных связей АТФ или другого анало­гичного трифосфата; лиазы, катализирующие реакции негидро­литического отщепления или присоединения различных химиче­ских групп органических соединений по двойным связям; изоме-разы, катализирующие реакции превращения органических соеди­нений в их изомеры.

В почве широко распространены и довольно подробно изучены оксидоредуктазы и гидролазы, имеющие очень большое значение в почвенной биодинамике. В гл. 4 приводятся методики определе­ния биологической активности четырех ферментных систем поч­венных микроценозов, используемых в практике биологического мониторинга.

2.4.2 Генетический подход

Наличие и степень проявления генетических изменений харак­теризует мутагенную активность среды, а возможность сохране­ния генетических изменений в популяциях отражает эффектив­ность функционирования иммунной системы организмов.

В норме большинство генетических нарушений распознаются и элиминируются клеткой, например путем апоптоза за счет внут­риклеточных систем или посредством иммунной системы. Досто­верное превышение спонтанного уровня таких нарушений явля­ется индикатором стресса. Генетические изменения могут выяв­ляться на генном, хромосомном и геномном уровнях. Принято выделять следующие типы мутаций. Генные, или точковые, — их делят на две группы: замены оснований в ДНК и вставки или выпадения нуклеотидов, приводящие к сдвигу рамки считывания генетического кода. Генные мутации делят также на прямые и об­ратные (реверсии). Мутации типа сдвига рамки считывания зна­чительно менее склонны к спонтанным реверсиям, чем мутации типа замен оснований. Хромосомные перестройки (аберрации) зак­лючаются в различных нарушениях структуры хромосом. Геномные мутации — изменение количества хромосом в ядре.

Относительно просты, хорошо воспроизводимы и высокочув­ствительны генетические тесты, основанные на оценке измене­ния хромосом в соматических клетках (изменения кариотипа, хро­мосомные аберрации, сестринские хроматидные обмены, микро­ядра и др.).

Для выявления канцерогенов и мутагенов применяются крат­косрочные генетические тесты.

Уже давно известно, что некоторые химические вещества спо­собны вызывать рак у человека. Относительно недавно пришло и постоянно ширится понимание того, что химические вещества способны вызывать мутации в половых клетках человека, которые повышают частоту генетических или наследственных заболеваний. Многие тысячи химических веществ, включая фармакологические препараты, бытовые химические вещества и пищевые добавки, пестициды и нефтепродукты, уже присутствуют в окружающей среде, и каждый год в нее поступают все новые и новые химичес­кие соединения. Помимо этого существуют и природные хими­ческие вещества, относительно которых известно, что они обла­дают мутагенной и/или канцерогенной активностью (например, микотоксины, содержащиеся в пищевых продуктах). Поэтому важ­но, чтобы химические вещества, воздействию которых люди под­вергаются преднамеренно (например, во время терапевтических процедур), в повседневной жизни (это, в частности, относится к бытовым химическим веществам, косметическим средствам и т. п.), по недосмотру или небрежности (как в случае с пестицидами), испытывались на способность вызывать рак и генетические нару­шения (мутации).

Относительно немногие химические вещества идентифициро­ваны в качестве канцерогенов благодаря установленной связи этих веществ с возникновением рака у человека. Однако канцероген­ная активность обычно определяется на основании способности какого-либо вещества вызывать опухоль у лабораторных живот­ных в результате воздействия на протяжении жизни. Исследова­ния такого рода могут длиться в течение двух или трех лет и тре­буют дефицитных реактивов и высококвалифицированных специалистов. Это обстоятельство привело к поиску альтернатив­ных путей выявления химических веществ, обладающих канцеро­генными свойствами, в результате чего был разработан ряд срав­нительно недорогих тестов, во многих из которых вместо цельно­го организма млекопитающих используются другие биологичес­кие системы. Поскольку на проведение тестов уходит значительно меньше времени, чем на классические долгосрочные исследова­ния на грызунах, их стали называть краткосрочными тестами.

Известно, что генетические дефекты являются причиной зна­чительной доли заболеваний у человека, однако до сих пор не ясно, в какой мере присутствующие в окружающей среде хими­ческие вещества обусловливают генетические болезни. Это неуди­вительно, поскольку вероятность такой опасности для здоровья определяется на протяжении жизни по меньшей мере одного по­коления.

Информация, определяющая признаки клетки или организма, содержится в генетическом материале клетки, состоящем из де-зоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). ДНК состоит из субъеди­ниц — нуклеотидов, которые в свою очередь состоят из пятиугле-родного сахара (2-дезоксирибозы), остатка фосфорной кислоты и пуринового или пиримидинового азотистого основания. Эти субъ­единицы образуют в пространстве спиралевидную двунитчатую структуру. Каждая из двух нитей представляет собой последова­тельность молекул дезоксирибозы, связанных в цепь молекулами фосфорной кислоты. Обе нити связаны друг с другом водородны­ми связями, располагающимися между комплементарными пара­ми пуриновых и пиримидиновых оснований. Комплементарными парами оснований являются гуанин (пурин), который связан с цитозином (пиримидином), и аденин (пурин), связанный с ти-мином (пиримидином). Уникальная последовательность основа­ний, объединенных в тройки, или триплеты, образует генетиче­ский код: каждый триплет кодирует определенную аминокислоту. Последовательность триплетов и обеспечивает уникальность ин­формации, необходимой для синтеза функционального белка или фермента. Такую функциональную последовательность оснований называют геномом. Генетическая информация передается от од­ного поколения клеток к другому путем точного удвоения нитей и равного разделения ДНК перед клеточным делением (митозом в соматических клетках или мейозом в половых), благодаря чему обеспечивается надежное наследование всех признаков каждым последующим поколением. Данный фундаментальный генетиче­ский процесс является общим для всех организмов — от простой клетки до сложного организма млекопитающего или растения. У эукариотических организмов длинные нити ДНК связаны с бел­ками (гистонами) и организованы в отдельные сложные структу­ры, называемые хромосомами, которые располагаются в клеточ­ном ядре.

Изменения информации, содержащейся в ДНК, возникают в результате изменений в структуре молекулы ДНК, отчего после­довательность оснований, передающаяся следующему поколению, оказывается нарушенной; это в свою очередь может приводить к появлению потомков, отличающихся по своим признакам от ро­дителей. Такие изменения называются мутациями, и, хотя многие мутации вредны, некоторые из них совместимы с нормальным, здоровым состоянием и обусловливают лишь мелкие различия между особями одного вида. Мутации такого вида являются дви­жущей силой эволюции.

Мутагенные химические вещества взаимодействуют с ДНК, вызывая изменения в ее структуре. Эти процессы могут приводить к потере, увеличению или замене оснований, изменяя тем самым их расположение в ДНК и влияя на точность передаваемой гене­тической информации.

Почти все краткосрочные методы, позволяющие получить ре­зультаты в течение максимум нескольких недель, основаны на демонстрации хромосомных повреждений, генных мутаций или повреждения ДНК, при этом многие из них являются тестами in vitro (т. е. проводятся на экспериментальных биологических систе­мах без использования целостных живых организмов). В этих тестах применяется очень широкий спектр организмов — от бактерий и дрожжей до насекомых, растений и культивируемых клеток мле­копитающих. Существуют также краткосрочные тесты, в которых лабораторные животные подвергаются воздействию изучаемого химического вещества на протяжении периодов от нескольких часов до недель.

Хотя в литературе описано более сотни тест-систем для иссле­дования генотоксичности, охватывающих различные организации живого — от бактериофага до млекопитающих, регулярно приме­няются менее 20 из них, а некоторые доступны лишь в специали­зированных лабораториях.

Чаще всего для выявления мутагенных химических веществ применяются тесты с использованием бактерий; эта группа те­стов в целом и наиболее апробирована. В отличие от эукариоти­ческих организмов, у которых ДНК организована в сложные хро­мосомные структуры, у бактерий присутствует лишь одна кольце­вая молекула ДНК, которая легкодоступна для химических ве­ществ, проникающих сквозь клеточную стенку. Бактериальные тесты имеют также то преимущество, что в одном опыте может быть получена популяция, состоящая из многих миллионов кле­ток с относительно коротким периодом размножения. В класси­ческом варианте используются штаммы бактерии, уже имеющие мутации по определенным генам. Мутации, индуцированные тес­тируемым веществом, так называемые обратные мутации, выяв­ляются в результате роста таких «ревертантных» бактерий с обра­зованием колоний в соответствующей селективной среде. Бакте­риальные тесты могут быть использованы для выявления мутаген­ных метаболитов в биологических жидкостях (например, в моче, цельной крови, плазме) животных или людей, подвергшихся воз­действию химических факторов.

На основе штаммов сальмонеллы были созданы полуколиче­ственные и количественные тесты для оценки мутагенной актив­ности. Количественные тесты целесообразно использовать в целях определения частоты мутаций, а также в тех случаях, когда иссле­дуемые вещества являются высокотоксичными и вызывают ги­бель большей части клеток тест-объекта. Поэтому наиболее широ­кое распространение получил ставший классическим полуколи­чественный тест Эймса с метаболической активацией in vitro (или, как его иногда еще называют, тест Эймса сальмонелла/микросо­мы).

Непрямым доказательством повреждения ДНК в клетках мле­копитающих может служить проявление репарационной актив­ности ДНК. Репарация ДНК может быть выявлена с помощью простого теста на культивируемых клетках млекопитающих, ос­нованного на измерении «репарационного», или «внепланово­го», синтеза ДНК. В его основе лежит следующее явление: тимидин включается в ДНК в процессе как нормального, так и репа­рационного синтеза. Клетки, подвергшиеся воздействию пред­полагаемого химического мутагена, обрабатывают тимидином, меченным радиоактивным изотопом (тритием), на такой стадии клеточного цикла, когда нормального синтеза ДНК не происхо­дит или он подавлен. Количество меченого тимидина, обнару­женного в ДНК, является показателем репарационного синтеза и, следовательно, отражает степень первичного повреждения ДНК.

Химические вещества можно оценить в отношении их способ­ности индуцировать хромосомные повреждения у растений, насе­комых и млекопитающих. Для млекопитающих обычной тест-сис­темой является культура клеток, можно использовать какую-либо перевиваемую клеточную линию или культуру лимфоцитов чело­века. Для изучения повреждения хромосом in vivo хорошо разра­ботан метод анализа метафазных хромосом в клетках костного мозга крыс, мышей или хомячков. Кроме того, хромосомные фрагмен­ты в некоторых клетках костного мозга и других тканей можно идентифицировать в виде микроядер: так называемый микроядер­ный тест зарекомендовал себя как сравнительно простой метод выявления химических веществ, способных индуцировать хромо­сомные повреждения.

2.4.3 Морфологический подход

В условиях техногенного воздействия на природные экосисте­мы снижение численности популяций происходит в значитель­ной мере за счет эмбриональной и личиночной смертности. Эмб­рионы и личинки — наиболее чувствительные к повреждающим факторам фазы жизненного цикла гидробионтов. Воздействие на организм стрессирующих факторов приводит к отклонениям от нормального строения различных морфологических признаков. В московских и подмосковных водоемах за последние 20 лет ката­строфически возрос процент уродливых личинок лягушек и жаб. Отмечено появление рыб с нарушениями эмбрионального мор­фогенеза, т. е. с различными аномалиями (асимметрия тела и т.д.). В пригородных водоемах и малых реках, по данным гидробиоло­гического мониторинга, исчезли многие виды гидробионтов. Про­цессы воспроизведения организмов — это сложная цепь взаимо­обусловленных событий, любое из звеньев которой может быть нарушено воздействием токсичной среды.

Для диагностики воздействия загрязнений на морфологические характеристики применяются методы оценки флуктуирующей асим­метрии.

Симметрия как вид согласованности отдельных частей живых организмов имеет общебиологическое значение. При работе с био­логическими объектами в настоящее время используется класси­фикация асимметрий (нарушения симметрии) по Л. Ван Валену (Van Valen, 1962), согласно которой они подразделяются на три типа:

 1) направленная асимметрия, когда какая-то структура раз­вита на одной стороне больше, чем на другой (сердце млекопита­ющих);

2) антиасимметрия — большее развитие структуры на од­ной из сторон (правша и левша в популяции человека);

3) флуктуирующая асимметрия — незначительные ненаправленные от­клонения от строгой билатеральной симметрии.

Флуктуирующая асимметрия является результатом неспособ­ности организмов развиваться по точно определенному плану. Раз­личия между сторонами не являются генетически детерминиро­ванными и не имеют адаптивного значения. Выступая в качестве меры стабильности развития, флуктуирующая асимметрия харак­теризует состояние морфогенетического гомеостаза — способно­сти организма к формированию генетически детерминированно­го фенотипа при минимальном уровне онтогенетических наруше­ний. Таким образом, флуктуирующая асимметрия может быть оха­рактеризована как одно из наиболее обычных и доступных для анализа проявлений случайной изменчивости развития.

Возможность использования асимметрии в биоиндикации по­казана многими авторами, которые убедительно доказали на при­мере различных видов растений и животных, что вели­чина асимметрии реагирует на различные стрессоры антропоген­ного характера и может являться мерой нарушения развития орга­низма. Флуктуирующая асимметрия — это один из общих онтоге­нетических показателей, характеризующий стабильность индиви­дуального развития, дающий оценку состояния природных попу­ляций и зависящий от состояния среды. Величина флуктуирую­щей асимметрии и ее зависимость от определенных факторов мо­жет быть определена лишь на популяционном уровне. Кроме того, В. М.Захаровым показано, что флуктуирующая асимметрия явля­ется практически единственной формой фенотипической измен­чивости с известной причиной обусловленности.

2.4.4 Физиологический подход

Одна из наиболее важных характеристик, высокочувствитель­ная к стрессовому воздействию среды, — энергетика физиологи­ческих процессов. Наиболее экономичный энергетический обмен имеет место лишь при строго определенных условиях среды, ко­торые могут быть охарактеризованы как оптимальные. Интенсив­ность энергетического обмена аэробного организма может быть определена посредством измерения скорости потребления кис­лорода. При оптимальных условиях организм находится на самом низком энергетическом уровне, при любых негативных измене­ниях среды обитания потребность в кислороде будет увеличи­ваться.

Для характеристики энергетического обмена две величины яв­ляются фундаментальными: основной обмен и максимальный об­мен. Основной обмен отражает минимальный уровень потребле­ния энергии, необходимый для обеспечения нормального функ­ционирования организма при отсутствии каких-либо внешних воздействий. Максимальный обмен соответствует предельному количеству энергии, которое организм способен выработать в слу­чае необходимости. Разность между этими величинами представ­ляет энергетический ресурс адаптации конкретного вида живот­ных, поскольку основной и максимальный уровни обмена явля­ются видоспецифическими величинами.

Другая базовая характеристика, перспективная для оценки стрессовых воздействий, — темп и ритмика ростовых процессов.

В качестве тест - функций применяются физиологические пара­метры пресноводных беспозвоночных гидробионтов разных уровней филогенеза.

Свойства внешней среды, и в частности гидросферы, прояв­ляются в интенсивности воздействия на организм или популяцию отдельных факторов или их комбинаций. Вещества, поступающие в водоем антропогенным путем, могут оказывать регулирующее, трофическое, токсическое и информативное воздействие на гидробионты. При незначительных концентрациях в водоеме эти ве­щества можно выявить, оценивая физиологический статус гоме­остатических показателей организма, которые могут изменяться при сдвигах в окружающей среде.

Наибольший интерес представляют типы поведения, относя­щиеся к эволюционно-универсальным реакциям, свойственным всем эукариотам, включая человека. К таким феноменам относят­ся спонтанная двигательная активность как врожденная форма поведения и память — приобретенная форма поведения.

В опытах на инфузориях показателями исходного функциональ­ного состояния служили объективно регистрируемые реакции: спонтанная двигательная активность, уровень спонтанных сокра­щений, уровень пищевой возбудимости, состояние ядерного ап­парата. Была продемонстрирована применимость основных физи­ологических показателей, используемых в опытах на позвоночных животных, для определения функционального состояния организ­мов, лишенных нервной системы. Исследования поведенческих реакций в ответ на внешнее воздействие проводились на пресноводной гидре Hydra attenuate, имеющей примитивную нервную систему. Оценивались реакции привыкания к раздражителю, при этом критерием выработки привыкания служило сокращение щупалец гидры. В экспериментах на плоских червях планариях Polycelis nigra, Euplanaria gonocephala, Dugesia tigrina (примитивный мозг — зачатки цефализации) были изучены основные реакции гидробионтов на экологически значимые раздражители. В дальней­шем для оценки качества водной среды стал успешно применять­ся метод выработки условных рефлексов у планарий.

Целостное поведение животных рассматривается как лабиль­ное взаимодействие врожденных и приобретенных элементарных реакций, необходимое для быстрой и эффективной адаптации к условиям среды. Изучение поведения сложно и требует тщатель­ных наблюдений в природе, подкрепленных лабораторными эк­спериментами. Возникшие на заре эволюции закономерности по­ведения у простейших сохраняются и у более развитых живот­ных.

Таким образом, поведение является эволюционно обуслов­ленным показателем физиологического состояния животного. На основании изменений в поведенческих феноменах одного вида животных можно прогнозировать нарушения поведения и других видов. Выбор форм поведения для биотестирования определяет­ся их чувствительностью к изменениям, происходящим в окру­жающей среде.

2.4.5 Иммунологический подход

В дополнение к цитогенетическому подходу, характеризующе­му эффективность иммунной системы организма в отношении элиминации клеток с генетическими нарушениями, возможны развернутая оценка изменений иммунореактивности животного, исследование параметров иммунитета, таких как состав крови и гемолимфы, определение наличия антител в жидкостях организ­ма, концентрации белков плазмы, перивисцеральной жидкости и гемолимфы, оценка динамики клеточного состава.

Основная функция иммунной системы состоит в поддержании постоянства внутренней среды организма. Иммунная система одна из самых лабильных, поэтому любые серьезные изменения в сре­де обитания влияют на функциональную активность иммунокомпетентных клеток. Значительные по величине и продолжительно­сти неблагоприятные воздействия приводят к перенапряжению, истощению и рассогласованию в функционировании отдельных звеньев иммунитета и, как следствие, к развитию иммунодефи­цита. Все иммунологические тесты по оценке иммунного статуса млекопитающих дают информацию о трех основных клеточных популяциях иммунной системы. К ним относятся:

1) Фагоцитиру­ющие клетки, обеспечивающие захват и переваривание чужерод­ных или измененнных собственных клеточных структур;

2) Т - лимфоциты, регулирующие взаимодействие клеток внутри системы с помощью цитокинов; они осуществляют распознавание и унич­тожение генетически чужеродных и измененных клеток организ­ма, дают сигнал В-лимфоцитам к продукции антител;

3) В - лимфоциты, продуцирующие антитела иммуноглобулиновой приро­ды, которые нейтрализуют действие чужеродных агентов и облег­чают фагоцитоз.

Иммунологический подход при оценке состояния окружаю­щей среды заключается в изучении изменений врожденного и при­обретенного иммунитета у беспозвоночных и позвоночных живот­ных.

Предлагается использовать параметры иммунитета животных как критерий состояния организмов, их популяций и сообществ экосистем в норме и при техногенном воздействии. Кроме того, разрабатываются технологии производства новых антимикробных и иммунотерапевтических препаратов на основе иммуномодули рующих веществ, выделенных из клеток и биологических жидко­стей гидробионтов.

Широко изучаются реакции врожденного иммунитета рыб, иглокожих, ракообразных, моллюсков, насекомых, червей. По­казано, что врожденный иммунитет низших позвоночных и бес­позвоночных животных во многом подобен таковому у млекопи­тающих и представляет собой совокупность реакций неспецифи­ческой антимикробной защиты, которая действует практически без латентного периода, с высокой эффективностью и избира­тельностью распознавания «своего» и «чужого». Антимикробные белки фагоцитов, гемоцитов и жидких сред организмов являются физиологически активными веществами, участвующими в реали­зации и обеспечении взаимодействия защитных реакций при фа­гоцитозе, воспалении и стрессе. К фагоцитам позвоночных жи­вотных относят нейтрофилы, эозинофилы, моноциты и макро­фаги; у беспозвоночных животных — это гемоциты и амёбоциты. Перечисленные клетки объединены в общий функциональный тип вследствие наличия у них ряда общих структурно-метаболических свойств и стереотипности поведения в фагоцитарном процессе. Биохимическая специализация фагоцитов заключается в присут­ствии у них развитого лизосомального (гранулярного) аппарата, где депонируются физиологически активные вещества антибио­тического действия.

Ведущую роль в уничтожении микроорганизмов играет группа катионных белков, таких как миелопероксидаза, лактоферрин, эластаза, катепсин G, лизоцим, дефенсины. Катионные полипеп­тиды, которые осуществляют первичную защиту от инфекций и ухудшения условий среды обитания, представлены в природе от простейших животных до человека. При ухудшении условий среды обитания или при атаке чужеродных агентов в целомической жид­кости беспозвоночных и в сыворотке крови позвоночных живот­ных происходит резкое нарастание фагоцитирующих клеток и, как следствие, антимикробных белков и катионных полипепти­дов, которые осуществляют нейтрализацию стресса или гибель внедрившихся чужеродных агентов. Изучение динамики реакций врожденного иммунитета у водных животных, например опреде­ление концентрации гемоцитов и лизоцима, обнаружение новых белков в сыворотке и целомической жидкости, определение на­личия специфических антител и сравнение этих параметров с нормой позволяет сделать выводы об изменении условий среды обитания или появлении заболеваний у животных.

Исследование параметров иммунологического статуса водных животных (рыб, моллюсков, морских звезд) в зависимости от изменений условий среды обитания, развития заболеваний или антигенного воздействия показало увеличение количества макро-фагоподобных клеток, концентрации лизоцима и, как следствие, появление в жидкостях организмов новых цитотоксических бел­ков и антимикробных пептидов.

Предложенная методология биотестирования пригодна для оценки любой наземной и водной экосистемы по тест - функциям растений и животных. Тестирование позволяет определять состоя­ние живых организмов по комплексу морфологических, генети­ческих, физиологических, биохимических, биофизических и им­мунологических параметров. Используемый набор методов иссле­дования и тестов охватывает разные стороны индивидуального раз­вития организма, обеспечивая интегральную оценку состояния биоты и Качества среды в целом.

Методы биотестирования просты, относительно недороги, пригодны для широкого применения и дают возможность оцени­вать качества природной среды при всем многообразии экологи­ческих изменений.

2.5 Практическое применение методологии биотестирования

Среди возможностей применения подходов биотестирования следует отметить их пригодность в мониторинге районов с интен­сивным развитием промышленности и сельского хозяйства. Кро­ме того, биотестирование позволяет провести беглое сканирова­ние больших пространств в целях ранней диагностики экологи­ческих нарушений. В данном случае достаточно ограничиться наи­более простыми, но эффективными методами, основанными, на­пример, на морфологических или физиологических показателях.

Обобщить результаты, полученные методами биотестирования, допустимо по всем методам в пределах каждого подхода; по всем подходам для каждого вида или группы видов живых организмов; для экосистемы в целом, что дает надежную суммарную оценку состояния среды и исключает ошибочное заключение, вполне возможное при использовании единичных показателей в отноше­нии отдельных видов. Итоговое заключение должно содержать ха­рактеристику качества среды в исследуемом районе (оценку сте­пени отклонения от нормы и фонового состояния; оконтурива-ние зоны ощутимых последствий воздействия) и оценку благо­приятности среды для человека.

Комплексная оценка качества среды обитания помимо исполь­зования разных подходов и тест - объектов биотестирования подразумевает организацию наблюдений за всеми природными сре­дами, в первую очередь за воздушной, водной и почвенной ком­понентами биосферы.

Организация наблюдений за загрязнением атмосферы. Такие наблюдения проводятся на стационарных, маршрутных и пере­движных (подфакельных) постах. Стационарные и маршрутные посты служат для проведения систематических наблюдений, пе­редвижные — для разовых наблюдений в зонах непосредственно­го влияния промышленных предприятий. Наблюдения под факе­лами дымовых труб предприятий проводятся с целью получения материалов по распределению вредных веществ от отдельных ис­точников выбросов в зависимости от метеоусловий и для получе­ния оценки их влияния на загрязнение атмосферы.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1.                  Егорова Е. И. Биотестирование и биоиндикация окружающей среды: учеб. пособие по курсу «Биотестирование» / Е. И. Егорова, В. И. Белолипецкая. — Обнинск: ИАТЭ, 2000.

2.                  Актуальные проблемы водной токсикологии / под ред. проф. Б.А.Флё-рова. — Борок : Ин-т биологии внутренних вод РАН, 2004.

3.                  Звягинцев Д. Г. Биология почв / Д. Г. Звягинцев [и др.]. — М.: Изд-во МГУ, 2005.

4.                  Захаров В. М. Асимметрия морфологических структур животных как показатель незначительных изменений состояния среды // Проблемы эко­логического мониторинга и моделирования экосистем. — Л.: Гидрометео-издат, 2001. — Т.4.

5.                  Мелехова О. П. Экспресс-метод биотестирования качества воды по метаболическому критерию / О.П.Мелехова [и др.]. — М.: РГОТУПС, 2000.